PRODUCTION DES METALLOPROTEINASES MATRICIELLESpdf
DANS LES VESICULES SEMINALES, LA PROSTATE ET LE CANAL
DEFERENT DU MERION DE LIBYE (MERIONES LIBYCUS) AU
COURS DE LA PERIODE ACTIVE DU CYCLE REPRODUCTEUR

Mansouria BELHOCINE1,2, , Thérèse GERNIGON2, Yasmina BENAZZOUG3, Jean-Marie
EXBRAYAT4
1 Département des Sciences Agronomiques, Faculté des Sciences Exactes et des Sciences de la Nature et de la
Vie, Université Abdelhamid Ibn Badis-Mostaganem, Algérie
2 Laboratoire de Recherche sur les Zones Arides (LRZA), Reproduction des Petits Vertébrés, Faculté des
Sciences Biologiques
3 Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, Matrice Extracellulaire, Faculté des Sciences Biologiques

4 Université de Lyon, Laboratoire de Biologie Générale, UCLy, Laboratoire de Reproduction et Développement



Résumé :

Une étude immunohistochimique des métalloprotéinases matricielles (MMP-3, MMP-7) a étéentreprise sur les vésicules séminales, la prostate et le canal déférent pour vérifier leur implication dans laphysiologie de la reproduction. Meriones libycus a été collecté dans la région de Béni-Abbès au printemps(période de reproduction).

La méthode immunohistochimique indirecte avec amplification à la streptavidinebiotine-peroxydase a été suivie avec l’AEC comme chromogène. Dans les vésicules séminales, la MMP-3 et laMMP-7 sont immunolocalisées dans les cellules épithéliales et les cellules musculaires lisses (CMLs) avec uneabsence d’immunomarquage dans la matrice extracellulaire (MEC) et la sécrétion. Dans la prostate ventrale,’immunoexpression de la MMP-3 et la MMP-7 est concentrée dans le pôle apical des cellules épithéliales avecune légère immunoréponse dans les CMLs et une absence d’immunoréactivité dans la MEC ; la sécrétion, sansimmunomarquage et creusée de zones circulaires vides de taille variable, est entourée d’une petite fraction dematériel marqué traduisant une résorption de la sécrétion ce qui facilite son écoulement dans les tubules. Dans laprostate dorsale, les deux MMPs sont aussi immunodétectées dans les cellules épithéliales avec une absence dela MMP-3 et une faible immunoréaction de la MMP-7 dans les CMLs ; l’immunoréactivité est importante dansla sécrétion et inexistante dans la MEC. Dans le canal déférent, les cellules épithéliales et les CMLs exprimentfortement les deux MMPs, et la lamina propria manque d’immunomarquage ; la sécrétion apocrine montre unsignal positif des deux MMPs. Les MMPs sont impliquées dans le flux de la sécrétion dans la prostate ventrale etsont vraisemblablement engagées dans l’élaboration de la sécrétion et la maturation des spermatozoïdes.Mots clés : Métalloprotéinases, Glandes accessoires mâles, Reproduction, Rongeurs, Désert.Abstract: An immunohistochemical study of matrix metalloproteinases (MMP-3, MMP-7) was undertaken onthe seminal vesicle, prostate and vas deferens of Meriones libycus in order to verify their implication in thecellular process of reproduction.

     Meriones libycus were collected from Beni-Abbes areas in the spring (breedingperiod).

    The work was done using the indirect immunohistochemistry protocol by amplification withstreptavidin-biotin-peroxidase and AEC as chromogen. In the seminal vesicles, the MMP-3 and MMP-7 were
mmunolocalized in epithelial cells and smooth muscle cells (SMC) without any immunostaining in theextracellular matrix (ECM) and the secretion. In the ventral prostate, MMP-3 and MMP-7 immunoexpressionswere concentrated in the apical pole of the epithelial cells with a less immunoresponse in SMC and a lack ofimmunoreactivity in the ECM. The not immunostained secretion was followed by empty circular areas of variable size and was surrounded by a small amount of an immunolabelled material.

    This phenomenon reflecteda detachment of secretion allowing its movement in the tubules. In the dorsal prostate, there were as well the
epithelial cells whose produced MMP-3 and MMP-7 with an absence of MMP-3 and a slight MMP-7immunoreaction in SMC; the secretion showed a strong immunolabelling. In the vas deferens, epithelial cells, SMC and secretion were strongly immunostained.

     MMPs are involved in the flow of secretion in the ventral prostate and are probably implicated in elaboration of secretion and subsequently in sperm maturation. Keywords: Matrix metalloproteinases, Male accessory sex glands, Reproduction, Desert, Rodents.

1. Introduction Les métalloprotéinases matricielles (MMPs)sont des endopeptidases extracellulaires dontl’activité est dépendante du Zn2+ et du Ca2+capables de dégrader tous les composants de lamatrice extracellulaire (MEC) et aussi des protéines non matricielles comme les facteursde croissance et leurs récepteurs, les cytokines et les chémokines, les peptides antimicrobiens, les protéines d’adhésion comme la E cadhérine et les b intégrines, les protéoglycannes de surface et une variété d’enzymes [1] ; [2] ; [3] .

    Par leur action protéolytique, elles peuvent produire des fragments bioactifs, libérer les facteurs de croissance immobilisés dans la matrice [4] et peuvent aussi activer, désactiver ou modifier l’activité des molécules de signalisation engendrant un microenvironnement favorable à l’expression des gènes, la migration cellulaire, la différenciation des cellules, la croissance et la prolifération des cellules, la survie et l’apoptose des cellules. Elles peuvent aussi modifier l’architecture des tissus par leur action sur les protéines de la MEC et le clivage des jonctions intercellulaires et de la lame basale [5] Les MMPs sont impliquées dans le remodelage tissulaire associé à des processus physiologiques normaux tels que la reproduction, le développement embryonnaire et la morphogenèse [6] ainsi que le développement postnatal des organes [7] ; [8] le remodelage osseux et cartilagineux [9] ; [10] , la croissance du follicule pileux, l’angiogenèse et l’apoptose, et physiopathologiques comme notamment le cancer où elles sont fortement exprimées [11] ; [12] , les pathologies cardiovasculaires [13] ; [14] et les désordres du système nerveux central [15] ; [16] .

     Les rongeurs des régions tempérées et ceux vivant dans les zones arides se sont adaptés à ne pas se reproduire quand les conditions climatiques sont inappropriées à la croissance des petits. L’arrêt de l’activité reproductrice se manifeste par une atrophie structurale des organes reproducteurs corrélée à une chute de la production hormonale [17] ; [17] ; [19] , [20] ; [21] . Généralement le processus de la régression engendre des organes caractérisés par une accumulation de la matrice extracellulaire, une hypertrophie de la paroi fibromusculaire et une apoptose des cellules épithéliales conduisant à une involution épithéliale [23] ; [23] ; les effets de la castration sont similaires ([24] ; [25] ; [26] ; [27] .

    Les organes en recrudescence montrent une structure opposée avec un stroma dispersé et faiblement concentré, une paroi fibromusculaire mince et un compartiment épithélial largement dominant [28] ; [19] ; [22] .

     Ces variations saisonnières de structure traduisent un remodelage tissulaire qui ne peut avoir lieu sans l’implication de protéases. Ce phénomène a été observé dans l’ovaire et l’utérus du hamster sibérien (Phodopus sungorus), les MMPs sont à l’origine de la restructuration associée à la régression et la recrudescence de ces organes en réponse aux effets inhibant ou stimulant de la photopériode [29] ; [30] .
Les organes du système reproducteur des femelles subissent un remodelage cyclique de la MEC synchronisé avec les fluctuations cycliques hormonales, les MMPs jouent un rôle crucial dans ce remodelage et dans la physiologie ovarienne et utérine. Dans les ovaires, elles prennent part à toutes les phases de la croissance et l’atrésie folliculaire, L’ovulation, la formation et la lutéolyse du corps jaune [31] ; [32] . Dans le remodelage de la matrice extracellulaire de l’endomètre associé aux phases proliférative, sécrétoire, menstruel et au cours de l’implantation [31] ; [33] , la gestation, la dilatation cervicale et l’involution postpartum [2] .

    Dans la glande mammaire, elles apportent leur contribution pendant les phases du développement, la lactation et l’involution après le sevrage des petits [34] . L’importance des MMPs et des TIMPs dans la fonction de reproduction chez Des mâles a été démontrée par plusieurs auteurs chez l’homme et les mammifères, les travaux restent néanmoins limités. Des MMPs et des TIMPs ont été décelées dans le plasma séminal de l’homme [35] , [36] ; [37] . L’accumulation des MMPs et des TIMPs dans le fluide testiculaire et épididymaire des animaux domestiques serait un signe de leur fonction dans la maturation des spermatozoïdes [38] . Les MMPs auraient aussi un rôle dans la fusion des gamètes lors de la fécondation et dans la réaction acrosomique [38] ; [39] ; [40] ; [41] ; [42] .L

     e testicule est un organe hautement dynamique au cours de la vie foetale, le
développement postnatal et chez l’adulte. Au cours de la spermatogenèse, les cellules germinales doivent traverser la barrière hématotesticulaire pour migrer du compartiment basal vers le compartiment adluminal. Les jonctions membranaires reliant les cellules germinales à la cellule de Sertoli doivent être brisées ou restructurées pour permettre aux cellules germinales de se mouvoir dans l’épithélium séminifère et atteindre la lumière tubulaire ; au cours de la spermiation les spermatozoïdes sont détachés des cellules de Sertoli. Tous ces phénomènes impliquent des ruptures et des remises en place de ces barrières à la suite d’une protéolyse des protéines jonctionnelles et leur resynthèse. De toute évidence un système de protéases est requis pour accomplir tous ces évènements cellulaires. Ce système enzymatique est représenté par les sérines protéases et les MMPs. Celles-ci sont produites par les cellules de Sertoli, les cellules germinales, les cellules de Leydig et les cellules péritubulaires [43] ; [44] L’objectif de notre étude est de vérifier l’implication des MMPs dans les processus cellulaires de la fonction de reproduction du Mérion de Libye.

2. Matériel et méthodes
2.1. Les animaux
Le Mérion de Libye est un rongeur saharien nocturne appartenant à la famille des Gerbillidés, son régime alimentaire est à la fois herbivore et granivore. Il vit dans des terriers superficiels creusés sous les buissons les plus importants profitant de l’ombre que la plante procure. Dans le Sahara algérien Meriones libycus se reproduit selon un cycle saisonnier caractérisé par une courte période de reproduction (printemps-début de l’été) et une longue phase de repos (fin de l’été-fin de L’hiver).

     Meriones libycus a été capturé de la région de Béni-Abbès dans le sud ouest du Sahara algérien au milieu de la phase active par piégeage.

        Le piège est une cage grillagée appâtée avec des dattes et de l’orge grillée. C’est à la tombée de la nuit, juste avant les sorties nocturnes que les cages ont été déposées à proximité des orifices des terriers habités reconnaissables d’après les traces fraiches. Les Mérions piégés ont été récupérés tôt le matin puis transportés au laboratoire où les mâles adultes ont été placés dans des cages collectives (5 animaux par cage). Une nourriture composée de grains d’orge leur a été administrée quotidiennement.

      Après un séjour variable de 24 à 48 heures, 14 Mérions mâles adultes ont été sacrifiés entre 17 et 19 heures en raison de leur activité nocturne.

2.2. Immunohistochimie
Les vésicules séminales, la prostate ventrale, La prostate dorsale et le canal déférent ont été soigneusement prélevés, dégraissés, pesés puis fixés dans le Bouin-Hollande pendant 48 heures ou le formol neutre tamponné à 10% pendant 24 heures. Après déshydratation dans l’éthanol à concentration croissante jusqu’à l’éthanol absolu (70°, 96°, 100°) ces organes ont été inclus dans la paraffine. Les coupes de 5μm d’épaisseur ont été étalées sur des lames superfrost couvertes de quelques gouttes d’eau stérile. Les anticorps utilisés sont : [MMP-3: Mouse anti-human MMP-3 monoclonal antibody (AbCys); MMP-7: Mouse anti-human MMP-7 monoclonal antibody (AbCys)].

    La technique immunohistochimique employée est la méthode immunohistochimique indirecte avec amplification à la streptavidinebiotine- peroxydase selon le protocole d’immunohistochimie KIT LSAB2 (DAKO) peroxydase. Les coupes ont été déparaffinées par immersions successives dans deux bains de cyclohexane de 15 minutes chacun et hydratées pendant 5 minutes chacun dans des bains d’éthanol à degré décroissant 100°, 95° et 70° puis rincées dans l’eau distillée pendant 2 minutes. Après un rinçage de 2 minutes dans du PBS, les coupes ont été entourées d’une résine hydrophobe (DAKO-Pen) puis incubées pendant 5 minutes dans le mélange PBS-H2O2 à 3 % pour bloquer les peroxydases endogènes. Les sites antigéniques non spécifiques ont été masqués en incubant les lames pendant 10 minutes dans la solution PBS/BSA à 1% après un rinçage au PBS. L’anticorps primaire (anti-MMP-3, dilution :1/500 ; anti-MMP-7, dilution : 1/200) a été ensuite appliqué sur les coupes pendant une heure à température ambiante à raison de 100 ml par coupe. Les lames ont été ensuite rincées trois fois 10 minutes au PBS puis incubées dans l’anticorps secondaire biotinylé pendant une heure à température ambiante. Après 3 rinçages au PBS de 10 minutes chacun, le complexe streptavidine-peroxydase a été appliqué sur les coupes pendant une heure à température ambiante.

    Les coupes ont été ensuite rincées 3 fois 10 minutes au PBS puis incubées dans le complexe substrat-chromogène pendant 10 minutes à température ambiante. Les coupes ont été rincées dans l’eau distillée puis contrecolorées à l’hématoxyline QS spéciale pour immunohistochimie qui colore les noyaux en bleu-violet.

       Le montage des lames a eu lieu en milieu aqueux avec le VectaMount AQ (VECTOR laboratories). Les contrôles négatifs ont été réalisés par omission de l’anticorps primaire (témoin négatif 1) ou l’anticorps secondaire (témoin négatif 2) en les remplaçants par le PBS. L’observation et les photographies ont été effectuées sur un photo microscope Nikon Eclipse E400 muni d’une caméra numérique Nikon DXM1200.

3. Résultats
3.1. Immunohistochimie de la MMP-3 et la

MMP-7 dans les vésicules séminales Dans les vésicules séminales de Meriones libycus, la MMP-3 et la MMP-7 sont exprimées dans les cellules épithéliales (ˆ) et les cellules musculaires lisses (CMLs) (Fig. "1 a, b" ; "2 a, b"). Les cellules épithéliales (ˆ) et les CMLs expriment la MMP-3 et la MMP-7 avec la même intensité et l’aspect morphologique de cet immunomarquage est homogène (Fig. "1 a, b" ; "2 a, b"). Le stroma sous-épithélial (lamina propria) (¤) et le stroma logé dans l’axe des replis épithéliaux (k) ainsi que l’espace interstitiel (Œ) inséré entre les CMLs manquent d’immunoréaction à la MMP-3 et la MMP-7 (Fig. "1 a, b" ; "2 a, b").

3.2. Immunohistochimie de la MMP-3 et la MMP-7 dans la Prostate ventrale La MMP-3 et la MMP-7 sont concentrées dans les cellules épithéliales (ˆ) et légèrement exprimées dans les CMLs. La sécrétion (S) sans immunomarquage aux deux enzymes est entourée par un produit marqué (q) qui semble avoir digéré la sécrétion initiale et provoqué les trous ronds vides (˜) visibles dans la masse de
sécrétion (S) (Fig. "1 c, d" ; "2 c, d").

3.3. Immunohistochimie de la MMP-3 et la
MMP-7 dans la Prostate dorsale

La MMP-3 et la MMP-7 sont fortement exprimées dans les cellules épithéliales (ˆ) et dans la sécrétion (S). Dans les CMLs, la MMP- 3 est absente et la MMP-7 est légèrement exprimée (Fig. "1 e, f" ; "2 e, f"). 3.4. Immunohistochimie de la MMP-3 et la MMP-7 dans le canal déférent Dans le canal déférent, les cellules épithéliales (ˆ) et les CMLs expriment fortement et avec un taux identique la MMP-3 et la MMP-7, l’immunomarquage est surtout concentré aux extrémités apicale et basale des cellules.

     La lamina propria (k) incluse entre le compartiment épithélial et musculaire est dépourvue d’immunomarquage. Dans la lumière du canal déférent sont présentes des vésicules de sécrétion apocrine (^) attachées aux microvillosités apicales avec un signal immunohistochimique positif des deux métalloprotéinases (Fig. "1 g, h" ; "2 g, h"). Dans tous les témoins négatifs préparés par omission de l’anticorps primaire le signal immunohistochimique des deux MMPs est négatif.

4. Discussion

Dans les vésicules séminales, la prostate dorsale, la prostate ventrale et le canal déférent de Meriones libycus en période de reproduction, la stromélysine-1 (MMP-3) et la matrilysine (MMP-7) sont localisées dans les cellules épithéliales et les CMLs. Ce sont les CMLs des vésicules séminales et du canal déférent qui expriment fortement les deux enzymes. Dans les CMLs de la prostate dorsale et la prostate ventrale, les deux MMPs sont légèrement exprimées avec une absence d’immunoréactivité de la MMP-3 dans les CMLs de la prostate dorsale. Dans tous ces organes, le stroma conjonctif ne montre aucune immunoréponse. L’absence de la MMP-3 et la MMP-7 dans la sécrétion des vésicules
séminales montre bien que ces deux enzymes ne sont pas destinées à l’exportation, ce qui prouve davantage leur implication dans les processus intracellulaires. Ces deux types cellulaires expriment également des gélatinases (MMP-2, -9) dans les vésicules séminales et la
prostate ventrale [45] .
La lumière de la prostate ventrale renferme en abondance une sécrétion sans immunomarquage à la MMP-3 et la MMP-7 et est entourée d’une petite fraction de matériel marqué. Cette fraction marquée semble être à l’origine des zones circulaires vides visibles dans la sécrétion, c’est un phénomène de résorption de la sécrétion facilitant son cheminement dans les tubules, les mêmes observations ont été notées pour les gélatinases [45] . Dans la prostate dorsale, la sécrétion montre un aspect lisse et homogène et peut circuler aisément dans les tubules, sa forte immunoréponse n’a aucun lien avec la progression de la sécrétion, ces deux enzymes se mélangeraient au plasma séminal et pourraient servir à la maturation des spermatozoïdes. Dans le canal déférent, les vésicules de sécrétion apocrine fixées aux
microvillosités apicales expriment la MMP-3 et la MMP-7. La localisation immunohistochimique de la MMP-3 et la MMP-7 dans les cellules épithéliales et les CMLs montrent que ces enzymes accomplissent des fonctions différentes dans ces deux types cellulaires.
Dans les cellules épithéliales, ces deux enzymes seraient impliquées dans les processus cellulaires de l’élaboration de la sécrétion et dans les CMLs, elles auraient une action dans l’activité contractile pour l’expulsion de la sécrétion ou dans le remodelage tissulaire saisonnier.
Chez le rat, une activité gélatinolytique et caséinolytique calcium dépendante a été détectée avec des méthodes zymographiques dans la fraction soluble de la sécrétion prostatique dans tous les lobes avec une forte quantité dans le lobe ventral [46] . Aussi, le développement postnatal et la maturation du complexe prostatique et des vésicules séminales sont marqués par une forte activité caséinolytique évoluant avec leur maturité [47] ; [48] ; [49] . Chez le rat adulte, les gélatinases sont impliquées dans les processus
de la régression de la prostate ventrale provoquée par la castration et dans sa
régénération après une réinjection de testostérone [50] .
Dans la prostate normale du rat, le taux d’expression de la MMP-7 est faible, suggérant une capacité de transcription ou de synthèse limitée [51] . Pourtant, d’autres chercheurs ont démontré que la MMP-7 est un produit constitutif des glandes exocrines du corps ; elle a été détectée grâce à l’hybridation in situ et l’immunohistochimie dans l’épithélium de la glande mammaire, la parotide, le pancréas, le foie, la prostate et dans les acini séreux des glandes péribronchiales du poumon ainsi que les glandes du derme ; cette enzyme fait partie
intégrante de la fonction normale de ces glandes, elle prévient leur obstruction par le matériel de sécrétion et maintient le flux de la
sécrétion [52] ; [53] . Récemment, dans la prostate ventrale du rat, la MMP-7 étudiée avec des méthodes immunohistochimiques est restreinte aux cellules épithéliales où elle est isolée dans des granules, ceci est en accord avec le concept de son expression constitutive dans les glandes exocrines annoncé par [54] ; 3 jours après la castration, l’immunomarquage de la MMP-7 persiste dans les granules des cellules épithéliales et a été aussi observé dans le stroma à proximité de la lame basale, 21 jours après la castration la MMP-7 disparaît des cellules épithéliales et se concentre uniquement dans le stroma voisin de la lame basale avec un immunomarquage discontinue suggérant une action dans la dégradation de la lame basale.

La disparition de la MMP-7 des cellules épithéliales et son apparition dans le stroma conjonctif 21 jours après la castration montre une diffusion de l’enzyme dans l’espace extracellulaire et son immobilisation juste à côté de la lame basale pour prendre part au remodelage de l’interface épithélium/stroma de la prostate probablement la dégradation des composants de la lame basale [55] .
La MMP-7 est constitutivement exprimée par les cellules épithéliales des cônes efférents, le segment initial et la queue de l’épididyme, l’utérus juvénile et adulte. Une accumulation de a MMP-7 est en corrélation avec la maturation des organes : la MMP-7 est impliquée dans la fonction différenciée des organes adultes où elle s’exprime en plus de sa fonction dans la dégradation de la matrice extracellulaire et le remodelage tissulaire [56] . Une surexpression de MMP-7 conduit à une infertilité chez les mâles et une différenciation prématurée des glandes mammaires chez les femelles à la suite d’une altération de la matrice extracellulaire
[57] .
5. Conclusion
Chez Meriones libycus les organes reproducteurs mâles élaborent une sécrétion riche en MMP-3 et MMP-7. Ces enzymes sont immunodétectées dans les cellules épithéliales et les CMLs. Ces métalloprotéinases interviendraient dans les processus
intracellulaires de l’élaboration de la sécrétion et dans la contractilité des CMLs pour
décharger la sécrétion dans le milieu extérieur. Dans le plasma séminal, ces enzymes
participeraient à la coagulation et la liquéfaction du sperme, la maturation des spermatozoïdes et
les mécanismes moléculaires de la fécondation y compris la réaction acrosomique.
6. Remerciements
Les auteurs remercient tout le personnel de la station de Béni-Abbès dans le Sahara algérien. Les membres du Laboratoire de
Recherche sur les Zones Arides (LRZA) et ceux du Laboratoire de Biologie Générale de l'Université Catholique de Lyon sont également remerciés. J’adresse particulièrement mes remerciements les plus sincères aux membres
de l’unité INSERM U 698 de l’hôpital Bichat- Claude Bernard pour leur accueil chaleureux.
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